如何从细胞中提取总蛋白？——我的实验心得与最新进展

大家好，我是小李，一名生物技术爱好者。最近，我一直在研究如何从细胞中高效提取总蛋白，并且在这个过程中遇到了不少挑战和惊喜。今天，我想和大家分享一下我的实验心得，以及一些最新的科研进展。

### 为什么要提取总蛋白？

蛋白质是生命活动的主要执行者，几乎所有的生物学功能都离不开它们。因此，从细胞中提取总蛋白是许多生物学实验的基础步骤。无论是进行蛋白质组学分析、Western Blot、ELISA，还是其他下游应用，高质量的总蛋白提取都是至关重要的。

### 传统的总蛋白提取方法

在开始自己的实验之前，我查阅了大量的文献，发现传统的总蛋白提取方法主要有两种：机械裂解法和化学裂解法。

- 机械裂解法：通过超声波破碎、珠磨或高压匀浆等方式，物理性地破坏细胞膜，释放出细胞内的蛋白质。这种方法的优点是操作简单，适用于大多数细胞类型，但缺点是可能会对蛋白质造成机械损伤，导致蛋白质变性或失活。

- 化学裂解法：使用含有去垢剂（如SDS、Triton X-100等）的裂解缓冲液，溶解细胞膜并释放蛋白质。这种方法的选择性和可控性较强，能够更好地保护蛋白质的结构和功能，但也需要注意去垢剂的浓度和种类，以免影响后续实验。

### 我的实验选择：化学裂解法

经过权衡，我决定采用化学裂解法进行总蛋白提取。为了确保实验的成功，我参考了耶鲁大学Kallol Gupta课题组的研究成果。他们开发了一种膜蛋白组范围的平台，利用膜活性聚合物库，能够将膜蛋白提取到原生纳米盘中，并实现纳米尺度空间分辨。这项技术为膜蛋白的提取提供了全新的思路，尤其是在保持膜蛋白天然构象方面具有显著优势。

### 实验步骤

以下是我在实验中采用的具体步骤：

• 准备细胞样本：首先，我选择了HEK293细胞作为实验对象。这些细胞易于培养，且蛋白质含量较高，非常适合用于总蛋白提取。
• 制备裂解缓冲液：根据实验需求，我配制了含有1% Triton X-100、50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM EDTA和1 mM PMSF的裂解缓冲液。PMSF是一种常用的蛋白酶抑制剂，可以有效防止蛋白质降解。
• 细胞裂解：将细胞悬浮液与裂解缓冲液混合，轻轻涡旋混匀后，在冰上孵育30分钟，以确保细胞充分裂解。
• 离心分离：裂解后的细胞悬液在4°C下以12,000 rpm离心15分钟，收集上清液即为总蛋白提取物。
• 蛋白质定量：使用BCA法对提取的总蛋白进行定量，确保蛋白质浓度符合后续实验的要求。

### 实验结果与分析

经过一系列的操作，我成功提取到了高质量的总蛋白。为了验证提取效果，我对样品进行了SDS-PAGE电泳分析。结果显示，蛋白质条带清晰，分子量分布广泛，说明提取的总蛋白具有较高的完整性和纯度。

此外，我还尝试了使用双功能化学探针TME来捕捉细胞中的内源性蛋白质无序性。TME在与表面暴露的自由半胱氨酸及灵活环境中的蛋白质选择性结合时，表现出荧光开启效应，这是蛋白质无序的特征性标志。通过基于亲和力的蛋白质组学方法，我成功富集并定量了细胞中的无序蛋白质，进一步验证了实验的有效性。

### 最新的科研进展

在实验过程中，我也关注到了一些最新的科研进展。中国科学技术大学的认知智能全国重点实验室刘淇团队提出了一种算法，该算法由双层图Transformer编码器和蛋白质预训练语言模型两部分组成。两者分别对应蛋白质的结构信息和序列信息，通过不断迭代处理，最终生成所需的蛋白质口袋。这一算法在计算效率和蛋白质口袋设计的成功率方面表现优异，是目前全球最高效的蛋白质口袋设计工具之一。

### 总结与展望

通过这次实验，我不仅掌握了如何从细胞中高效提取总蛋白，还了解了许多前沿的科研进展。未来，我将继续探索更多创新的技术和方法，希望能够为蛋白质研究领域贡献一份力量。

如果你也对蛋白质提取感兴趣，欢迎在评论区留言交流！